TIRF-Mikroskopie

Die TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflections Fluorescence Microscopy) ist eine Spezialanwendung der (Fluoreszenz-) Konfokalmikroskopie. Bei der TIRF-Mikroskopie wird in der Regel ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur (NA) verwendet.

Von Dr. Jakob Bierwagen, AHF analysentechnik AG

Interne Reflexion des Anregungsstrahls

In das Objektiv wird das Anregungslicht mit einer ringförmigen Intensitätsverteilung eingekoppelt. Dadurch wird erreicht, dass das Licht nur in einem sehr flachen Winkeln auf die Grenzfläche zwischen Deckglas und Probe trifft. Da der Brechungsindex von Wasser (1,33) niedriger ist als der des Deckglases (1,53), kommt es zur totalen internen Reflexion des Anregungsstrahls. Lediglich das evaneszente Feld des Anregungslichts reicht 100 – 200 nm in die Probe herein.

Bessere Auflösung

Dadurch erreicht man, dass nur die Fluoreszenzmarker angeregt werden, die innerhalb dieses abklingenden Felds sind. Als Konsequenz daraus erreicht man eine viel bessere Auflösung der Bilder in Z-Richtung, als man sie bei normaler Konfokalmikroskopie erreichen würde (500 – 600 nm). Nachteil ist allerdings, dass man nur direkt am Deckglas aufnehmen kann. Dies ist aber z.B. interessant, wenn man Prozesse direkt auf der Zellmembran beobachten will.

Passende Strahlenteiler und Filtersets für TIRF

Damit man die nötige Strahlqualität für die ringförmige Intensitätsverteilung erreichen kann, benötigt man besonders flache Strahlenteiler. In der Regel setzt man Strahlenteiler ein, die eine Flachheit von <λ/5 haben. AHF bietet ihnen hierfür zahlreiche Strahlenteiler dieser Qualität und passende Filterwürfel an, um ihr Experiment zum Erfolg führen zu können.