STORM-Mikroskopie

STORM steht für "STochastic Optical Reconstruction Microscopy". Dabei handelt es sich wie bei PALM (Photoactivated Localisation Microscopy) und GSDIM (Ground-State-Depletion and Individual Molecule return) und vielen anderen ähnlichen Methoden um Einzelmolekül-Lokalisationsmethoden, die im Weitfeld-Modus arbeiten.

Von Dr. Jakob Bierwagen, AHF analyentechnik AG

Allen Methoden ist gleich, dass bei den Aufnahmen die allermeisten Moleküle dunkel sind (oder vorher in einen Dunkelzustand gebracht wurden). Nur wenige Moleküle sind in der Lage zu fluoreszieren. Diese müssen weiter als das Beugungslimit voneinander entfernt sein. Die emittierten Photonen werden auf einer schnellen Kamera detektiert. Anschließend gehen die Moleküle wieder in einen Dunkelzustand oder bleichen. Da man davon ausgeht, dass man nur individuelle Moleküle beobachtet, kann man das Zentrum der Emission berechnen, in dem man das Beugungsmuster der einzelnen Punkte mit passenden Funktionen (z.B. 2D-Glockenkurve) entfaltet.

Der Aufnahme und Rekonstruktionsprozess werden viele hunderte bis einige tausendmal wiederholt, sodass sehr viele Moleküle einzeln detektiert wurden. Die einzelnen Lokalisationsbilder werden anschließend übereinandergelegt, sodass ein komplettes Bild entsteht. Um eine gute Auflösung zu erreichen, ist es entscheidend die einzelnen fluoreszierenden Moleküle vom Hintergrund abtrennen zu können. Deswegen müssen sehr gute Anregungs- und Fluoreszenzfilter verwendet werden, um Hintergrundlicht ausschließen zu können.

Um eine Auflösung von 10–20 nm zu erreichen, ist es außerdem wichtig, dass der Strahlenteiler möglichst flach ist, da es sonst zu Verzerrungen kommt, die das Bild so verändern, dass es nicht mehr der Realität innerhalb der Auflösung entspricht. Daher werden auch bei diesen Methoden bevorzugt Strahlenteiler mit einer Flachheit von <λ/5 pro inch verwendet.