Die Multiphoton-Fluoreszenzmikroskopie
Bei der Multiphotonen-Mikroskopie werden Moleküle durch mehrere Photonen in einen elektronisch angeregten Zustand überführt. Von diesem Zustand relaxieren diese Moleküle durch Emission eines Photons wieder in den elektronischen Grundzustand. Dies hat zur Folge, dass das emittierte Photon eine höhere Energie (kürzere Wellenlänge) besitzt als die Photonen zur Anregung.
von Dr. Jakob Bierwagen, AHF analysentechnik AG
Um Moleküle durch mehrere (langwellige) Photonen anregen zu können, werden extreme Leistungsdichten des Lichts benötigt, da die Photonen quasi gleichzeitig mit dem Molekül wechselwirken müssen. Bei der Zwei-Photonen Anregung erklärt man sich quantenmechanisch die Interaktion so, dass sich das Molekül durch ein erstes Photon in einem angehobenen, virtuellen Energieniveau befinden, solange das Photon mit dem Molekül interagiert (wenige Femtosekunden, 10-15 sec).
Wenn innerhalb dieser kurzen Zeit ein zweites Photon kommt und mit dem Molekül interagiert, kann es in einen, nun reellen, elektronisch angeregten Zustand überführt werden. Von diesem Niveau relaxieret das Molekül nun in den Grundzustand. Dies kann auf unterschiedliche Weise funktionieren: Entweder handelt es sich um ein nicht fluoreszierendes Molekül. Dann wird „einfach“ ein Photon mit doppelter Energie abgegeben. Wenn man z.B. mit Photonen, die eine Wellenlänge von 800 nm haben einstrahlt, dann würde man eine Emission bei 400 nm erwarten. Diesen Effekt nennt man auch „Second Harmonic Generation“ (SHG), der auch bei vielen Laserkristallen verwendet wird, um z.B. Laserlicht der Wellenlänge 532 nm zu erzeugen, das ursprünglich aus einem NdYAG-Laser stammt, welcher bei 1064 nm emittiert.
Schwingungsangeregter Zustand bei Fluoreszenz
Falls es sich um ein fluoreszierendes Molekül handelt, wird das Molekül durch das zweite Photon nicht nur in einen elektronisch angeregten Zustand, sondern auch schwingungsangeregten Zustand gehoben, von dem es zunächst strahlungsfrei in den elektronisch angeregten, aber Schwingungsgrundzustand relaxiert. Von diesem Zustand aus geht es, unter Emission eines Fluoreszenzphotons in den elektronischen Grundzustand über (vgl. » Fluoreszenzmikroskopie). Die Anregung kann auch durch drei, vier oder noch mehr Photonen erfolgen, was aber immer höhere Leistungsdichten des Lichts für die Anregung erfordert, da sich die Zeitspanne für die Anregung nicht weiter erhöht.
Wie für die „normalen“ Ein-Photonen-Anregungsspektren von Molekülen, kann man auch Spektren für die Multiphotonen-Anregung messen. Da der Effekt der Multiphotonen-Anregung von der Nobelpreisträgerin Maria Goeppert-Mayer 1931 in ihrer Dissertation vorhergesagt wurde, wird ihr zu Ehren die Einheit des Wirkungsquerschnitt der Moleküle für die Zwei-Photonen-Anregung in „Goeppert-Mayer“ (GM) gemessen.
Vor- und Nachteile der Multiphotonen-Mikroskopie
Die Multiphotonen-Mikroskopie hat verschiedene Vor- und Nachteile im Vergleich zur Ein-Photonen-Mikroskopie:
Einblick in tiefere Schichten
Durch die meist im Infraroten-Bereich des Spektrum liegenden Wellenlängen wird das Anregungslicht weniger in den (biologischen/organischen) Proben gestreut, wodurch man in tieferen Schichten der Probe vordringen kann und ein größeres Volumen mit dem Mikroskop abscannen kann, ohne zu große Deformationen der Anregungs-PSF befürchten zu müssen.
Ausbleichen der Probe
Da man nur durch sehr hohe Leistungsdichten eine Multiphotonenanregung erreicht, geht dies nur durch starke Fokussierung des Lichts in der Probe. Dies führt dazu, dass man, vergleichbar mit der » Konfokalmikroskopie, die Probe Punkt für Punkt abscannen muss, was die Bildgebung eher langsam macht. Im Vergleich zur Konfokalmikroskopie wird aber kein Pinhole vor der Detektion benötigt, da die Emission sowieso nur im Fokus der Anregung stattfinden kann, wodurch man tendenziell mehr Licht detektieren kann. Dabei skaliert die Emission mit dem Quadrat der Anregungsleistung (bei Zwei-Photonen-Anregung). Durch die hohen Leistungsdichten im Fokus bleichen die Proben meist relativ schnell, was wohl, neben den teuren Lasern, der größte Nachteil der Multiphotonenmikroskopie ist.
Auflösung
Die Auflösung der Multiphotonen-Mikroskopie ist um die Wurzel der benötigten Photonen für die Anregung besser als es die Wellenlänge der verwendeten Photonen erwarten ließe (bei zwei Photonen um Wurzel 2 erhöht). Zu beachten ist aber, dass die Photonen eine (meist) zweimal größere Wellenlänge haben und dadurch intrinsisch eine nur halb so gute Auflösung bieten wie die Photonen, die für eine Einzel-Photonen-Anregung benötig werden würden. Daher ist die Auflösung effektiv sogar um die Wurzel der benötigten Photonen schlechter im Vergleich zur äquivalenten Einzel-Photonen Anregung.
Emissionen reflektieren
Wie bei der klassischen Fluoreszenzmikroskopie wird auch bei der Multiphotonen-Mikroskopie die Emission mithilfe desselben Objektivs gesammelt. Da die Emissionsphotonen eine kürzere Wellenlänge haben als die Anregungsphotonen muss man darauf achten, dass die Emission bei einem passenden Langpassfilter reflektiert wird und nicht, wie bei der klassischen Ein-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie transmittiert wird.
Dispersion
Um überhaupt in der Lage zu sein, die benötigten Leistungsdichten für die Multiphotonen-Mikroskopie zu erreichen, muss man gepulste Laser verwenden, die eine sehr kurze Pulslänge haben (meist um die 50 fs bis 300 fs lange Pulse, selten mehr 1-2 ps). Dies bedeutet aber auch, dass die Laserpulse kritisch auf Dispersion reagieren, z.B. wenn sie durch Glas gehen, wodurch die Pulslänge vergrößert wird und die Peak-Intensität sich verringert. Daher wird meist ein Puls-Kompressor für die Laserpulse im Anregungspfad benötigt, mit dem man diese lineare Dispersion kompensieren kann.
Dielektrische Filter
Problematisch wird es bei Reflektionen an dielektrischen Filtern (» Dielektrische Filter, PDF). Bei diesen wird das Licht an sehr vielen verschiedenen Grenzflächen der dielektrischen Beschichtung in unterschiedlichen Tiefen der Beschichtung reflektiert. Dadurch kommt es zur nichtlinearen Dispersion der Strahlen, die auch nicht durch Kompression kompensiert werden kann. Man muss auf die „Group Delay Dispersion“ (GDD) der Strahlenteiler achten. In Transmission ist die GDD der Strahlenteiler quasi linear und abhängig von der Dicke des Substrats. Diese kann kompensiert werden. In Reflektion dringen die unterschiedlichen Anteile des kurzpulsigen Laserlichts (nicht monochromatisch!) unterschiedlich tief und nicht linear in das Substrat ein, wodurch jeder Anteil des Lichts eine andere Weglänge zurücklegt.
Es ist allerdings möglich, beim Design für Multiphotonen-Strahlenteiler für einen gewissen Wellenlängenbereich die GDD möglichst gering zu halten. Hierfür werden spezielle „Low Dispersion Dichroics“ entwickelt.
Passende Strahlenteiler und optische Filter
Bei AHF analysentechnik finden Sie hierzu eine große Auswahl an passenden Strahlenteilern, die sich beim Einsatz in der Multiphotonenmikroskopie bestens bewährt haben. Wir beraten sie hierbei gerne bei der kompetenten Auswahl der passenden Filter für Ihr Mikroskop und Ihre spezifische Fragestellung. Dabei profitieren Sie von unserer langjährigen interdisziplinären Erfahrung in der Mikroskopie.